Una nuova proteina ibrida composta da superossido

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 6892 (2023) Citare questo articolo

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È stata preparata una nuova proteina ibrida composta da un complesso Cu(II) attivo con superossido dismutasi (CuST) e lisozima (CuST@lysozyme). I risultati delle analisi spettroscopiche ed elettrochimiche hanno confermato che CuST si lega al lisozima. Abbiamo determinato la struttura cristallina di CuST@lisozima con una risoluzione di 0,92 Å, che ha rivelato che il gruppo imidazolico His15 del lisozima si lega al centro Cu(II) di CuST in posizione equatoriale. Inoltre, CuST è stato fissato in posizione dalla debole coordinazione assiale del gruppo ossidrile Thr89 e dal legame idrogeno tra il gruppo guanidinio del residuo Arg14 e il gruppo ossidrile di CuST. Inoltre, la combinazione di CuST con lisozima non ha ridotto l’attività della superossido dismutasi di CuST. Sulla base di studi spettrali, elettrochimici, strutturali e calcoli di chimica quantistica, viene proposto un meccanismo di sproporzione di O2 catalizzato da CuST@lysozyme.

Gli organismi aerobici producono l'energia necessaria per sostenere la loro vita attraverso la respirazione aerobica. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) come i radicali idrossilici (·OH), l'ossigeno singoletto (1O2), il perossido di idrogeno (H2O2) e il superossido (O2–) sono gli inevitabili sottoprodotti di questo processo. Questi ROS causano gravi danni ossidativi a biomolecole come lipidi, carboidrati, ormoni, proteine e acidi nucleici. Tra questi ROS, l’O2– è prodotto da sistemi di trasporto degli elettroni, processi fagocitici, ossidazione enzimatica e proteine che trasportano ossigeno, come l’emoglobina e la mioglobina1. In condizioni protoniche, O2– reagisce con i protoni (H+) per produrre altri ROS, come ·OH e H2O22. Pertanto, la rimozione di O2– è una priorità per gli organismi aerobici. Per rimuovere l’O2– ed evitare il danno ossidativo indotto dall’O2–, gli organismi aerobici possiedono metalloenzimi noti come superossido dismutasi (SOD). Le SOD catalizzano la sproporzione di O2– in H2O2 e O2, come mostrato nella reazione (1):

Poiché le SOD svolgono un ruolo cruciale nella protezione delle biomolecole dal danno ossidativo, l’aspettativa di vita degli organismi si basa su un’efficiente attività SOD. Gli organismi con attività SOD più elevate hanno tassi di mortalità più bassi e viceversa3. Gli ioni metallici si trovano nei centri attivi delle SOD, che catalizzano la sproporzione di O2– per produrre H2O2 e O2 attraverso le reazioni (2) e (3), rispettivamente:

In base agli ioni metallici presenti nei centri attivi, le SOD vengono classificate in quattro categorie; Le SOD contenenti Ni, Fe, Mn, Cu e Zn sono note come NiSOD4,5,6,7,8, FeSOD9,10,11,12,13, MnSOD14,15,16,17,18,19 e CuZnSOD20. 21,22 rispettivamente. In questo studio, ci siamo concentrati sul CuZnSOD più diffuso, che contiene ioni Cu(II) e Zn(II) nel suo centro attivo. Mentre lo ione Zn(II) fissa la struttura di coordinazione secondaria attorno al centro attivo23, lo ione Cu(II) catalizza la reazione di sproporzione di O2–, come mostrato nelle reazioni (4) e (5) di seguito:

Per utilizzare il CuZnSOD nativo come agente di rimozione dell’O2, è necessario risolvere problemi quali il costo elevato e l’instabilità24. In questo contesto, i complessi di Cu(II) con basso peso molecolare sono stati segnalati come modelli SOD funzionali25,26. Tra questi complessi di Cu(II), quelli coordinati dall'acido salicilico come ligando sono stati segnalati come modelli SOD funzionali26. Il nostro gruppo ha anche riportato complessi di Cu(II) composti da porzioni di fenolato e L-amminoacidi27. Tuttavia, questi composti di coordinazione possono essere tossici per le biomolecole dopo il rilascio di ioni Cu(II) dai loro ligandi28. Per risolvere questo problema, ci siamo concentrati sulla forte capacità legante degli ioni Cu(II) delle proteine29.

In questo studio, come primo approccio, abbiamo studiato la formazione di una proteina ibrida composta da lisozima, che abbiamo scelto per la sua stabilità e cristallinità, e un complesso funzionale Cu(II) mimetico SOD. Si prevedeva che questa proteina ibrida SOD-mimetica migliorasse la biocompatibilità e la stabilità del complesso Cu(II) del modello SOD funzionale.

14), forming an imidazolate anion. When the pH of the solution is between 6 and 14, the imidazole group is neither protonated nor deprotonated. Therefore, in pH 7.0 solution, imidazole can bind to the Cu(II) center in the neutral state. Although this UV–vis spectral behavior was not sufficiently quantitative to determine the binding constants, the spectral change was qualitatively saturated. In addition, CuST-Imi was obtained through the reaction of CuST with 1 eq. of imidazole in good yield (77.8%). Based on these results, we presume that CuST binds sufficient well with the imidazole group of His15./p>

> 2000 μM). Both CuST-Imi and CuST showed higher SOD activities than CuCl2, indicating that the SOD activity of the CuST unit was retained, even when CuST was bound to lysozyme. These results indicated that lysozyme acquired SOD activity by forming a composite with CuST. Unfortunately, the SOD activity of the CuST unit did not improve upon binding to lysozyme. This is because the hydroxyl group of CuST forms hydrogen bonds with the guanidinium group of Arg14, neutralizing the positive charge. As a result, O2– ions cannot form strong electrostatic interactions with the guanidinium group of Arg14, although hydrogen bonds play an important role in fixing the CuST unit to lysozyme./p>

was compared to the expected S(S + 1) for the spin state (doublet state). In all the calculations performed, the spin contamination was found to be less than 3% and therefore negligible. The structures of the complexes were visualized using ChemCraft software Ver. 1.660. To model the optical properties, the 120 lowest excitation states were chosen. An increasing number of excitations resulted in bands in the deep-ultraviolet region of the spectrum, which was not the target region of this research. Calculations were performed for the isolated molecules and molecules in the solvent medium (water). A polarizable continuum model was adopted for the latter61. The molar absorptivity, ε (L mol−1 cm−1), was calculated using the GaussSum 3.0 program package62. The g-tensor and hyperfine coupling constants (A-tensor) were calculated using the ORCA 5 program package63. A hybrid Becke three-parameter functional (B3LYP) was used in combination with the Pople basis set (6-311G(d,p)). The A-tensor was obtained as the sum of three contributions: the isotropic Fermi contact (AFC), anisotropic dipolar (\({\mathrm{A}}_{x, y, z}^{D}\)), and spin–orbit coupling term \({(\mathrm{A}}_{x,y,z}^{SO})\). This approximation reproduces the target parameters64,65./p>